文献翻译PLoSPathogRavN是

大家好，今天给大家推荐一篇年2月发表在PLoSPathog上面的文章“RavNIsaMemberofaPreviouslyUnrecognizedGroupofLegionellaPneumophilaE3UbiquitinLigases”，文章的通讯作者是来自美国EuniceKennedyShriver国家儿童健康与人类发育研究所的MatthiasPMachner博士。其课题组主要研究方向是微生物的发病机制。其实验室广泛使用嗜肺军团菌——一种潜在的致命呼吸道感染（称为军团病）的病原体作为其模式生物，致力于深入分析嗜肺军团菌利用人类宿主并引起疾病的机制。

摘要：真核生物泛素化机制可催化小蛋白修饰剂泛素与细胞靶蛋白的共价结合，从而改变其下游通路。微生物病原体通过编码E3泛素连接酶（E3泛素连接酶是催化泛素化级联反应最后一步的真核酶）的分子类似物来利用这种翻译后修饰过程。在这篇文章中，作者发现了嗜肺军团菌效应蛋白RavN属于一类不断增长的细菌蛋白，其模仿宿主细胞E3连接酶以利用泛素化修饰途径。RavN的E3连接酶活性位于其N末端区域，并依赖于与E2泛素结合酶的特定亚群的相互作用。RavNN端区的晶体结构显示了一个与其他U-box结构域有些相似的U-box基序，表明RavN是一个经历了重大进化改变的E3连接酶。预测的E2结合界面内残基的取代使RavN失去活性，表明尽管结构发生了重大变化，E2的识别方式仍然是保守的。使用基于隐马尔可夫模型（hiddenMarkovmodel-based）的二级结构分析，作者鉴定并通过实验验证了另外四个以前不被认为具有E3连接酶活性的嗜肺菌效应物，包括Lpg/SdcB（SidC的新旁系同源物）。作者的研究提供了有力的证据证明，嗜肺菌将其效应物库的很大一部分专门用于操纵宿主的泛素化途径。

作者总结：细菌病原体通常通过编码真核生物酶分子的类似物来劫持保守的宿主途径，从而诱使宿主细胞将其“资源”交给细菌。在这篇文章中，作者发现细胞内病原体嗜肺军团菌使用这种策略来利用泛素化（一种由E3泛素连接酶介导的保守翻译后修饰）。嗜肺菌编码宿主E3连接酶的分子类似物，包括效应蛋白RavN，从而在感染过程中了改变宿主泛素化途径，为其自身存活带来了益处。利用蛋白质晶体学，作者发现RavN的折叠仅与传统的真核生物E3相似，但其与E2酶（对泛素转移反应很重要的宿主蛋白）的相互作用方式在整个进化过程中被保留下来。受RavN发现的启发，作者进行了计算机折叠同源性（silicofoldhomology）研究，并在嗜肺菌的效应物库中发现了几个其他E3连接酶候选基因，到目前为止，由于缺乏一级序列相似性，这些候选基因仍没有被发表。作者的研究支持以下假设：E3连接酶是嗜肺菌毒力程序的重要组成部分，这些效应物尽管经历了广泛的进化改变，但仍然保留了对其生物学功能至关重要的特征，包括劫持泛素化机制中部分宿主因子的能力。

前言：泛素化是细胞生物学中最重要和最广泛的翻译后修饰之一。它影响着几乎所有的细胞过程，包括蛋白质的动态平衡和运输，信号转导和细胞周期进程。泛素化的标志是76个氨基酸的蛋白质泛素（Ub）与底物蛋白的共价结合，这一过程需要三类酶的依次作用：Ub激活酶（E1s），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s）。E1以三磷酸腺苷（ATP）依赖性的方式与Ub形成硫酯键，并将Ub转移到E2内的活性位点半胱氨酸（Cys）残基上。从那里开始，Ub通过E3连接酶转移到目标蛋白上，大多数情况下E3连接酶促进Ub的C末端甘氨酸（Gly）残基与目标蛋白的赖氨酸残基的ε-胺之间形成异肽键。Ub的一级序列包含七个Lys残基（分别位于6、11、27、29、33、48和63位），多聚泛素链可以通过不同的Lys连接形成。连接的类型最终决定了底物蛋白质的命运。例如，带有Lys48连接的多聚泛素链的蛋白质被26S蛋白酶体标记降解，而Lys63连接的多聚泛素链的蛋白质调节内吞作用和蛋白质定位。就像大多数翻译后修饰一样，泛素化可以被称为去泛素化酶的特定肽酶逆转，该酶从底物蛋白中去除单个泛素分子或整个泛素链。

E3泛素连接酶由于能够同时识别底物蛋白和E2-泛素结合物，因此在泛素化系统中起着核心作用。现已鉴定出多种真核E3连接酶，并根据其折叠和催化机理将其分为两大类：HECT（与E6-AP羧基末端同源）型E3s在泛素转移到底物蛋白之前，通过其活性部位的Cys残基与泛素蛋白形成瞬时中间体，RING（非常有趣的新基因）或U-box型E3s通过将E2-泛素结合物与目标蛋白紧密结合，以实现Ub转移（特别是没有形成共价E3-Ub中间体的时候而充当支架发挥作用）。考虑到泛素化在真核细胞生理学和蛋白质调节中的重要性，这种翻译后修饰被编码E3连接酶分子类似物的多种病原体所利用并不奇怪。例如，沙门氏菌效应蛋白SopA是一种HECT型E3连接酶，可通过泛素化来调节促炎性反应。同样，假单胞菌AvrPtoB（一种U-box型E3型连接酶），泛素化宿主激酶从而抑制植物的先天免疫。除了使用宿主E3的分子类似物之外，细菌还进化出了新型的E3连接酶，尽管与真核蛋白缺乏相似性，但它们仍依赖E2介导的泛素化。这些NELs（新的E3连接酶）包括来自沙门氏菌的效应物SspH1和SspH2，来自根瘤菌的NopM以及来自志贺氏菌的几个IpaH蛋白家族成员。因此，病原体已经以多种方式获得或利用了E3连接酶，从而证明了泛素化对于微生物毒性的重要性。

嗜肺军团菌是一种兼性细胞内病原体，在军团菌病（一种潜在的致命性肺炎）期间，会在周围的变形虫内和肺泡巨噬细胞内复制。该革兰氏阴性细菌将近种效应蛋白转运到被感染的宿主细胞中。这些效应物中只有一小部分已被详细表征，而由于缺乏与数据库中其他条目的一级序列同源性，它们中的大多数功能未知。到目前为止，已经证实总共有五个嗜肺菌效应蛋白通过改变或模拟E3连接酶活性来利用宿主细胞的泛素化作用：LegAU13/AnkB和LegU1包含F-box结构域，一个50个氨基酸的结构域，可与SCF（Skp，Cullin，含F-box）复合物相互作用，从而使底物蛋白泛素化，而LubX和GobX是包含U-box域的E3连接酶。尽管GobX靶标的识别还没有确定，但它利用宿主介导的S-酰化（棕榈酰化）定位于高尔基体膜这一事实表明，它在该区室处或附近发挥作用。与GobX不同，LubX具有两个U-box域，并介导宿主蛋白Clk1（类cdc2的激酶1）的多泛素化。另外，LubX是一种元效应物（meta-effector），可泛素化另一个嗜肺菌效应物SidH，并将其靶向降解。效应物SidC增强了内质网（ER）募集到含军团菌的囊泡上（LCV），并介导LCV上多聚泛素结合物的形成。SidC及其旁系同源物SdcA的E3连接酶折叠与已知的E3连接酶（包括NEL家族）不同，代表了细菌E3连接酶的另一个家族。最近，效应蛋白的SidE家族的成员被证明促进泛素化，特别是以一种E1和E2-非依赖性方式。SidE的单ADP-核糖基转移酶（mART）结构域使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）代替ATP，通过ADP-核糖基化的泛素中间体激活泛素。然后，ADP-核糖基化的泛素蛋白中的磷酸二酯键，被SidE的核苷酸酶-磷酸水解酶（NP）结构域切割，从而形成磷酸-核糖基化的泛素蛋白，并随后附着于底物蛋白。毫无疑问，利用宿主泛素化机制的嗜肺菌效应物之间的结构和机制的多样性表明，泛素化对于成功感染具有重要作用，但这种宿主-病原体相互作用的真正机制尚未完全确定。

使用蛋白质生物化学，结构生物学以及计算机模拟研究的组合方法，作者发现并表征了先前未被识别的一组具有E3泛素连接酶活性的嗜肺军团菌效应物，这表明嗜肺菌利用宿主细胞泛素化途径的作用范围比以前预期的更广泛。

讨论：在本研究中，作者发现并鉴定了嗜肺菌中，几种先前未被鉴别的E3连接酶，包括RavN和SidC旁系同源物Lpg（或“SdcB”），从而使该生物的E3库扩大到十种。多种结构和功能多样的泛素连接酶表明，利用宿主的泛素化机制对于嗜肺菌的毒力程序比最初想象的更为重要。在作者的研究之前，已经证实了六个嗜肺菌蛋白利用了宿主的泛素化。根据与已知E3的一级序列同源性发现了四个（LegU1，AnkB，LubX和GobX），而另外两种（SidC和SidE家族蛋白）是根据结构数据或功能分析确定的。同时考虑到二级结构的相似性，作者发现了一些具有E3连接酶活性的额外的嗜肺菌效应物，由于缺乏与已知E3的一级序列同源性，在先前的计算机研究中被遗漏了。

暴露于哺乳动物细胞的细胞质后，RavN表现出强大的多泛素化信号（图1A至1C），随后作者在体外重组分析中验证了其E3连接酶活性（图1D）。这是出乎意料的发现，因为RavN与已知的E3均未显示一级序列或二级结构同源性。然而，RavN1-的晶体结构（图3）显示其三维折叠与U-boxE3连接酶（如人Ark2C和大肠杆菌NleG）具有残余相似性，表明了RavN确实是真正的E3连接酶。尽管相似性主要限于中央β-折叠，但嗜肺菌已通过进化过程中早期的相似基因转移获得了这种效应物，然后随着时间的推移对其结构进行了改变，以最好地发挥其功能。值得注意的是，尽管进行了广泛的结构改变，但在所有已知的军团菌RavN同源物中，组成宿主E2结合界面的RavN（Ile8，Leu43和Pro47）中的残基仍是保守的，与其他U-boxE3中的残基相似（图4和S2A图）。在各种测定中，这些残基的取代显著降低了RavN的E3连接酶活性（图4），与其对E2-泛素结合的重要性相一致。Phe是RavN同系物中另一个保守的残基（S2A图），最有可能为E2结合界面提供结构支撑（图5E），并且在不改变RavN的三维折叠的情况下（图S5AandS5B），去除该残基会削弱RavN的泛素化活性(图5DandS5D)。从所有已知RavN同源物的一级序列构建的系统发育树（S2B图）与从其编码物种的整个基因组序列组装而成的系统发育树（S1A图）完全平行，这表明RavN很有可能是由一个共同的嗜肺军团菌祖先在单个相似基因转移事件中获得的。

RavN的C末端结构域（-位残基）不是本文所述结构的一部分，它也可能与胞质中尚未鉴定的靶蛋白结合（S1D和S1E图）。螺旋α3（对于多泛素化的发生是必不可少的）（图5C），在蛋白质晶体的不对称单元内显示出广泛的构象不均一性（图5A和5B）。作者的发现提出了一个模型，其中α3可能是一个互连的连接物，它使RavN的相邻N末端域和C末端域相对于彼此呈现不同的方向（S8图）。α3螺旋的移动可能会使被C末端结构域结合的目标蛋白与E3结构域上的E2-泛素复合物紧密结合，从而可以更有效地发生泛素转移。对于沙门氏菌SopA和大肠杆菌NleL也有类似的观察，包含HECT结构域的E3连接酶，在其催化循环中发生了大量构象变化。

图6.鉴定和验证以前无法识别的E3连接酶效应物。

（A）基于细胞的泛素化测定。表中列出了在基于细胞的泛素化测定中测定的嗜肺军团菌效应物，及其预测的E3类型。（C）上图：Lpg和SidC的示意图。下图：Lpg与其他军团菌种的同源物的一级序列比对。（D）Cys-His-Asp催化三联体对Lpg的E3连接酶活性至关重要。

使用二级结构预测模型，作者发现了除了RavN以外还有四个新的嗜肺军团菌E3连接酶候选物（Lpg，Lpg，Lpg和Lpg/SdcB）（当在哺乳动物细胞中产生时，它们显示出强大的自身泛素化活性）（图6A）。实际上，它们的泛素化水平与SidC相当，表明它们在这种测试的条件下具有活性。Lpg/SdcB在体外重组测定中还显示出催化多聚泛素化的作用，而Cys57-His-Asp催化三联体对该活性至关重要（图6D）。鉴于Lpg/SdcB和SidC-SdcA之间预测的折叠同源性仅限于N端个氨基酸（图6C和S6D图），这是一个令人惊讶的发现。但是，它确实进一步证实了作者的假设，尽管嗜肺菌效应物在一级和二级结构水平发生了重大变化，但在整个进化过程中仍保留了对其功能至关重要的特征。

值得注意的是，尽管Lpg/SdcB和SidC-SdcA具有相似的催化结构域，但它们的C端区域组成完全不同。虽然SidC-SdcA具有识别磷脂酰肌醇4-磷酸（PI（4）P）的膜结合域，但Lpg/SdcB包含一个锚蛋白重复区域，最有可能介导蛋白质-蛋白质相互作用。Lpg/SdcB和SidC-SdcA在感染过程中是否存在功能冗余尚未确定，但测序的嗜肺军团菌菌株之间缺乏协同性则有利于这种可能性（S9图）。无论其宿主靶点的识别如何，嗜肺军团菌效应物中几个泛素连接酶家族的新成员的发现，都强调了动态靶向宿主泛素化途径的能力，对于嗜肺军团菌毒力的重要性。(Linetal.)

LinY.H.,LucasM.,EvansT.R.,Abascal-PalaciosG.,DomsA.G.,BeaucheneN.A.,RojasA.L.,HierroA.,MachnerM.P.()RavNisamemberofapreviouslyunrecognizedgroupofLegionellapneumophilaE3ubiquitinligases.PlosPathogens,14(2).