干货qPCR实验中关于CT值问

qPCR实验在分析CT时常常遇到这几类问题，比如：

复孔间重复性差，是否都和操作有关？

无模板阴性对照出现CT值时，目的基因的CT值是否还能用？

CT值很大该怎么办？

今天就给大家分享下，在qPCR实验中遇到关于CT值的常见问题时该如何解决。

复孔间重复性差怎么办？

复孔间重复性差一般会有以下两种情况：

（1）CT值很大，如CT≥30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的CT值差异较大。

解决方法：如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的△CT值为3or5以上，那CT值为准确的，可多设置几个复孔，选择重复性好的CT值参与计算。

（2）CT＜30，重复性较差。这种情况一般同操作有关。

解决办法：从以下几个方面进行问题的排查：①加样准确度；②移液器吸取液体的准确度；③定期校准qPCR仪。

①加样准确度

避免小体积加样，减少加样误差。可以将引物、SYBRGreenMix、ddH2O配置成混合体系，并且增加模板的稀释梯度，大体积加样。如：原液cDNA添加1μL，可以更改为原液cDNA稀释5倍，添加5μL，使用ddH2O补齐体系至20μL即可。

SYBRGreenMix、配置的混合体系需要混合均匀。从-20℃冰箱拿出的试剂需要完全融化并上下颠倒彻底混匀；配置体系时，将混在一起的Mix用移液器吹打混匀。

②移液器吸取液体的准确度

移液器量程定期校准，校准周期为1年。

购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导致吸取量程不准确。

在吸取相同量程的液体体积时，注意观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。

③定期校准qPCR仪

一般qPCR仪校准周期为一年。

NTC（无模板阴性对照）出现CT值，目的基因的CT值还能使用吗？

NTC（无模板阴性对照）出现扩增一般会有两种情况：

（1）通过观察融解曲线，NTC与目的基因融解曲线峰形不重叠。一般NTC的Tm值较目的基因Tm值小。

这种情况下，NTC的CT值是由引物二聚体造成的，并不影响目的基因CT值的采集。

（2）NTC与目的基因融解曲线峰形重叠。NTC的Tm值等于目的基因的Tm值。

这种情况下，说明体系已被气溶胶污染了。那么，体系被污染，目的基因的CT值还能正常使用吗？

需要计算目的基因的CT值与NTC的CT值的差值（△CT）来判定。

若△CT≥5，说明气溶胶带来的污染对体系影响非常小，可以忽略不计。

如果达不到△CT≥5的程度，△CT≥3也可以认为气溶胶的污染程度很低，目的基因的CT值可正常使用。

若△CT＜3，说明污染已经很严重了，目的基因的CT值是不能使用的。

造成CT值偏大的因素较多，主要分为以下两大类情况：

（1）相同体系，前期实验CT值正常，本次实验，所有基因扩增CT值皆偏大。

这种情况下，需要排查RNA是否存在降解。如何判定RNA是否存在降解呢？可通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

完整度好的RNA是有三条带的，以真核生物为例，三条带分别是28s、18s、5s，且28s条带的亮度是18s的两倍，5s最暗（下图左）。

如果RNA发生降解，会出现三条带的亮度发生变化，甚至不存在完整的三条带。如果28s几乎看不到了，整个泳道Smear严重，说明RNA的降解已经很严重了，此时RNA不建议用作后续的逆转录实验（下图右）。重新提取RNA重复实验。

（2）该基因第一次扩增，其CT值偏大，而其余基因的CT值正常。

这种情况下就需要判定是因为基因的扩增效率低导致的CT值偏大，还是基因本身的表达量低造成的CT值偏大。

如何判定是因为基因的扩增效率低导致的CT值偏大，还是基因本身的表达量低造成的CT值偏大呢？首先需要计算引物的扩增效率。

可将基因的扩增产物进行梯度稀释（至少三个梯度，且梯度之间的△CT均一，防止因为操作原因导致标准曲线线性关系差，进而影响扩增效率的计算），同时进行qPCR。将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算。

关于引物扩增效率的计算，可参考下面的案例：

①qPCR扩增：

将qPCR产物进行原液、1/10、1/梯度稀释，每个梯度设置三个复孔，进行qPCR扩增，复孔间CT值取平均值，得到三组CT值。

②标准曲线绘制及扩增效率计算：

可以在excel上进行扩增效率的计算。稀释梯度可以设置为-1、-2、-3，每个梯度对应的CT值分别为23.69、27.04、30.27，如下图，进行标准曲线绘制。

通过标准曲线可以得到线性方程（y=-3.29x+20.42）与R2值（R2=0.）。将线性方程得到的斜率（-3.29）带入扩增效率计算公式中：，即可得到扩增效率：.35%。

只有当扩增效率满足90~%，且标准曲线R2≥0.99，引物的扩增效率才是合格的，定量出来的CT值才可以用来计算。且扩增效率越接近%，引物的扩增性能越优。

若扩增效率不满足90~%，那CT值偏大是因为扩增效率不达标导致的，需要重新设计引物。

若引物的扩增效率满足90~%前提下，CT值仍然很大，则是基因本身表达量低造成的CT值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的方法是改为探针法进行定量。探针法的灵敏度是高于染料法的。

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文章来源：诺唯赞

图片来源：诺唯赞

题图来源：图虫创意

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